免疫熒光方法中的重要環節如下：

   1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

   2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

   3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min.

   4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中*重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h,而4度*和從冰箱拿出后37度復溫45min.具體條件還要摸索。

   5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。*，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。

   6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。

   7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

   8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M.（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

   9、拍照：有條件的話*立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，過90min,高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以*多不得過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。*中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源*裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。